Enzyme
Enzyme
• 효소는 생명체 내부의 화학 반응을 매개하는 고분자 단백질 촉매임.
• 효소는 기질과 결합하여 효소-기질 복합체를 형성함으로써 활성화 에너지를 낮추는 역할을 함.
• 효소는 특이적이고 다양하며, 매우 효과적인 생촉매임.
• 효소의 이름은 –아제 (-ase)로 끝남.
Enzyme
• 단백질 효소들은 효소 활성을 위하여 비단백질기를 필요로함.
- 금속이온: Mg, Zn, Mn, Fe 등
- 보조효소 (coenzyme): NAD, FA, CoA 와 일부 비타민
• Holoenzyme = Apoenzyme + Coenzyme
효소 분류
Enzyme
• 단백질 효소들은 효소 활성을 위하여 비단백질기를 필요로함.
- 금속이온: Mg, Zn, Mn, Fe 등
- 보조효소 (coenzyme): NAD, FA, CoA 와 일부 비타민
• Holoenzyme = Apoenzyme + Coenzyme
효소의 작용
효소의 작용
효소 속도론
• 효소 촉매 반응: Michaelis-Mention 속도론 또는
포화속도론
효소 속도론
• 단순효소 속도론의 수직적 모형
• 산물생성속도 또는 기질소모속도 (moles/L•s)
• ES 복합체의 변화속도
• 효소에 대한 보존식:
효소 속도론
• 빠른 평형 가정
- 빠른 평형 가정은 효소와 기질이 반응하여 ES 복합체를 형성하는 과정이 빠르게 평형상태에 도달한다고 가정한다면 평형상수를 사용하여 [ES]를 [S]의 함수로 표시할 수 있다는 것임.
• 평형상수:
• 만일 효소가 보존된다면,
효소 속도론
• 유사평형상태
- 효소-기질 반응이 포화형태의 속도론을 보이긴 하지만, 많은 경우 빠른 평형가정은 물질 이동 속도식에는 적용되지 않음.
- 대부분의 실험은 초기에는 효소농도에 비해 충분히 높은 기질농도를 유지하는 회분식 반응기를 이용함.
- 효소 농도 가 충분히 낮기 때문에 라고 가정하면,
효소 속도론
• 유사평형상태
이전 두 식을 에 대입해서 정리하면,
효소 속도론
• 유사평형상태
이므로, 대입해주면 식은
(Dissociation constant)과 같이 정의하면
Km 값이 작으면 High affinity를, Km 값이 크면 Low affinity를 가짐.
효소 속도론 – 속도상수 결정
• 이중역수 도포 (Lineweaver-Burk 도표)
효소 속도론 – 속도상수 결정
• Eadie-Hofstee 도표
효소 속도론 – 속도상수 결정
• Hanes-Woolf 도표
효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델
• 알로스테릭 효소 (Allosteric enzymes)
- 알로스테릭 또는 협동결합 (cooperative binding) 은 하나 이상의 기질결합부위를 가지고 있는 효소가, 기질이 효소와 결함하면 다른 기질 분자의 결합을 촉진하는 현상을 말함.
- 조절효소 (regulatory enzyme)이 이 현상을 따름.
- 속도식:
여기서 n은 협동계숙 (cooperativity coefficient)이고, n>1은
양성협동상태를 나타냄.
효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델
• 알로스테릭 효소 (Allosteric enzymes)
- 협동계수는
으로부터 위의 그래프와 같이
과 을 도식화함.
효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델
• 저해반응에서의 효소속도론
- 어떤 물질은 효소와 결합하여 효소의 활성도를 감소시키는데 이와 같은 물질을 효소저해제 (enzyme inhibitors)라고 함.
- 효소 저해 반응은 가역적이거나 비가역적임.
- 가역적 효소 저해 반응은 경쟁적, 비경쟁적, 그리고 반경쟁적 저해 반응의 3가지 형태로 구분됨.
효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델
• 저해반응에서의 효소속도론
- 경쟁적 저해제는 구조가 기질과 매우 비슷하여 저해제와 기질이 효소의 활성부위를 놓고 경쟁함.
- 효소-저해제 복합체가 형성되면 기질과 결합할 수 있는 효소의 양이 줄어들고 따라서 반응속도가 감소함.
효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델
• 저해반응에서의 효소속도론
- 여기에서
효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델
• 비경쟁적 저해제는 기질과 유사성이 없음.
- 저해제는 효소의 활성부위가 아닌 다른 부위에 결합하여 기질의 효소에 대한 친화성을 감소시킴.
효소 속도론 – pH와 온도의 영향
• pH 효과
- 어떤 효소들은 활성부위에 이온을 갖고 있으며, 이들 이온은 효소의 촉매기능을 위해 적합한 형태로 존재하여야 함.
- 반응액의 pH가 변하면 활성부의 이온형태가 변화되고, 효소의 활성도가 바뀌게 되고 결국 반응속도고 변함.
- pH의 변화는 또한 효소의 3차원 구조에 영향을 미치기 때문에, 효소는 특정 pH영역에서만 활성을 가짐.
- 반응액의 pH는 효소의 최대반응속도와 Km값 그리고 효소의 안정성에도 영향을 미칠 수 있음.
- 기질 자체가 이온기를 갖고 있어서 반응액의 pH에 의해 효소에 대한 기질의 친화력에 영향을 미치는 경우도 있음.
효소 속도론 – pH와 온도의 영향
• pH 효과
효소 속도론 – pH와 온도의 영향
• pH 효과
- 이온화 효소에 대한 효소반응속도와 pH의 영향.
- 속도식
또는
효소 속도론 – pH와 온도의 영향
• pH 효과
- 속도식
또는
여기에서
- 결과적으로 효소의 최적 pH는 pK1 와 pK2 사이에 존재함.
효소 속도론 – pH와 온도의 영향
• pH 효과
- 이온화된 기질의 경우 아래의 반응경로와 속도식을 전개할 수 있음.
- 효소의 최적 pH를 이론적으로 예측하기 위해서는 효소의 활성부위의 특성을 아는 것이 중요하지만, 이는 매우 어렵다.
- 효소의 최적 pH는 주로 실험에 의해 구해짐.
효소 속도론 – pH와 온도의 영향
• 온도의 효과
- 효소-촉매반응의 속도는 일정 한계까지 온도에 따라 증가함.
- 특정 온도 이상이 되면 효소가 변성되어 온도가 증가하여도 효소의 활성도는 오히려 감소함.
- 효소는 최적온도가 존재하는데, 증가하는 영역을 온도활성화라고 함. 이때의 반응속도는 Arrehenius 식을 따름.
효소 속도론 – pH와 온도의 영향
• 온도의 효과
효소 속도론 – pH와 온도의 영향
• 온도의 효과
- 감소하는 영역을 온도 비활성화 또는 열변성이라고 함.
- 온도에 의한 변성속도는
초기효소 농도이고 kd는 비활성상수임.
- kd: Arrhenius 식의 형태로 온도에 따라 변함.
Ed는 비활성화 에너지 (kcal/mol)임.
- 결과적으로
효소 속도론 – pH와 온도의 영향
• 온도의 효과
- 효소-촉매반응의 활성화 에너지의 범위는 4 ~ 20kcal/g•mol 정도임.
- 비활성화 에너지 Ed 는 40~130 kcal/g•mol 정도임.
- 온도에 의한 효소의 변성은 효소 활성화보다 급속하게 일어남.
효소고정화
• 효소 고정화: 한정된 공간 속에 효소의 이동성을 제한하는 것임.
• 효소를 고정화 시키면 효소 재이용이나 효소의 회수 및 정제공정의 생략과 같은 장점이 있음.
• 효소 활성을 위하여 더 좋은 환경이 마련될 수도 있음.
• 효소의 값은 비싸므로, 효소의 재 사용은 많은 공정에서 핵심적인 요소임.
효소 고정화
효소고정화
• 고정화 효과
- 고정화 효소의 확산저항은 여러 수준에서 관찰됨.
- 이러한 저항은 지지체의 특성 (공극성, 비공극성), 지지체 주위의 유체역학적 조건, 효소의 지지체내부 또는 표면의 분포에 따라 변함.
- 확산저항이 효소반응속도에 미치는 영향은 효소 반응속도와 기질확산속도의 상대 값에 따라 다름.
- 상대속도는 Damkoehler (Da) 수에 의해 규정됨.
는 용액중의 기질농도 , 은 물질전달계수 (cm/s)
효소고정화
• 고정화 효과
- 효소전환속도는 Da 값에 따라 효소반응속도 또는 기질확산속도에 의해 제한 받을 수 있음.
- Da >>1 이라면 확산속도에 의해, Da <<1 이라면 반응속도에 의해 제한 받는 것이고, Da ≈ 1 이라면 반응과 확산저항이 비슷한 것임.
효소고정화
• 비공극성 지지체 표면에 부착된 효소의 확산효과
- 효소가 비공극성 지지체 표면과 결합하여 균일하게 분포되어 있고 모든 효소가 똑같은 활성을 가지며, 기질은 다음 그림과 같이 지지체 표면 주위의 얇은 액막을 확산 통과하여 반응이 일어나는 표면에 도달한다고 가정함.
- 고정화 공정은 효소 구조는 물론 고유속도상수 (Vm, Km)를 변화시키지 않는다고 가정함.
효소고정화
• 비공극성 지지체 표면에 부착된 효소의 확산효과
- 정상상태에서 효소 반응 속도는 물질전달 속도와 같음.
V’m 은 외부표면적당 최대반응 속도이고, kL은 액체물질전달계수임.
- 물질전달에 의해 강하게 제한 받을 경우 (Da >>1), 즉 일 때, 효소반응이 물질전달보다 빠르므로 효소계는 겉보기 일차반응을 나타냄.
효소고정화
• 비공극성 지지체 표면에 부착된 효소의 확산효과
- 효소반응이 제한받을 때 (Da <<1),
반응속도는
- 겉보기 Michaelis-Menten ‘상수’ 는 교반속도의 함수임. 보통 Km,app는
값처럼 실험으로 측정되며 최대반응속도의 절반 값을 나타냄.
효소고정화
• 공극성 격자 속에 고정화된 효소들의 확산효과
- 효소가 다공성 격자의 내부 공극 표면에 고정화되었을 때 기질은 공극사이의 비꼬인 통로를 통해 확산한 뒤에야 비로소 공극표면의 효소와 반응함.
효소고정화
• 공극성 격자 속에 고정화된 효소들의 확산효과
- 효소가 구형지지입자 속에 균일하게 분포되어 있고, 효소가 Michaelis-Menten 기작을 따르고 지지체 안팎에 기질농도의 변화가 없다면, 다음 식처럼 정상상태에서 확산속도와 반응속도는 서로 같다고 할 수 있음.
- 경계조건은 r = R 일 때 , r=0 일 때 임.
여기서 Vm 은 지지체의 위 부피당 최대반응속도이고, De는 공극 격자 안에서의 기질의 유효확산계수임.
효소고정화
• 공극성 격자 속에 고정화된 효소들의 확산효과
- 고정화된 효소의 진정한 고유 속도 상수를 얻기 위하여 작은 크기의 입자를 사용하거나 입자 주위를 강하게 저어 주거나, 높은 농도의 기질을 사용함으로써 확산저항을 제거하여야 함.
효소의 대규모 생산
• 대량으로 생산되는 효소는 주로 과잉생산균주로부터 생산됨.
• 생물체로부터 특정한 효소를 분리, 정제하기 위해서는 다양한 분리, 결정화와 건조과정 등이 필요함.
• 공정의 체계는 효소가 세포 안에, 혹은 세포 밖에 있는 가에 따라 달라짐.
• 어떤 경우에는 효소활성은 유지하고 있으나 나머지 기능은 불활성화 되어 있는 세포를 고정화된 형태로 사용하는 것이 더 유리할 수 도 있음.
효소의 대규모 생산
• 효소의 대규모 생산의 첫 단계는 효소를 생산하는 생물체를 배양하는 것임.
• 효소의 생산은 제어될 수 있으며, 효소의 과잉생산을 위하여 배양조건을 최적화 할 수 있음.
• 배양단계가 끝나면 배지로부터 세포를 분리하는데, 보통은 여과를 이용하나 때로는 원심분리도 이용함.
• 효소가 세포 안 또는 세포 밖에 있느냐에 따라 효소의 분리, 정제를 위해서 세포나 배양액을 더 처리하기도 함.
효소의 대규모 생산
• 어떤 경우에는 효소가 세포 안과 밖에 공존하는 경우가 있음. 이러한 경우에는 배양액과 세포를 동시에 처리하여야 함.
• 세포내 효소는 세포막의 투과성을 향상시켜 배양액으로 분비시킬 수 도 있음.
• 이러한 목적을 위해 CaCl2와 같은 염류나 DMSO와 같은 화학약품, 또는 pH 전이가 사용되고 있음.
• 효소의 분비가 완전하지 않다면 세포를 파괴해야만 함.
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